Agrobacterium tumefaciens
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Reich
Bacteria

Mikroskopische Ausnahme auf Rhizodermis (verändert nach 1)
Familie
Rhizobiaceae
Gramfärbung
negativ
Form
Stäbchen
Begeißelung
peritrich
Dauerstadium
bildet keine Sporen
Vorkommen
Rhizosphäre
Pathogenität
phytopathogen (induziert pflanzliche Tumore)
Meldepflicht nein

Allgemeines
Das gramnegative Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens kann potenziell bei allen dikotyledonen Pflanzen Tumore , sogenannte Wurzelhalsgallen, induzieren. Diese erscheinen im frühen Stadium der Infektion als kleine, weiße Vorsprünge am Spross- Wurzel- Übergang der befallenen Pflanzen. Mit zunehmender Größe dann fleckig- dunkelbraun und können einen Durchmesser von 30 cm erreichen. Im Herbst verfaulen die Tumore, treten im darauffolgenden Frühling aber wieder hervor. Infizierte Pflanzen sind in ihrer Entwicklung gehemmt, produzieren kleinere Blätter und sind empfindlicher gegenüber Umwelteinflüssen. Deshalb kommt es beim Befall von Nutzpflanzen zu Ertragsminderung. Sie ist das Ergebnis der Expression von Genen bakteriellen Ursprungs, die stabil ins pflanzliche Genom integriert werden. Die bakteriellen Gene veranlassen die Pflanzenzelle zur Überproduktion der Phytohormone Auxin und Cytokinin sowie der nicht-pflanzlichen Aminosäuren der Octopinklasse. Es entsteht eine unkontrollierte Zellproliferation.

Aufbau des Ti-Plasmids und Transfer in die Pflanzenzelle

Als extrachromosomales Element enthält A.tumefaciens das ca. 220000bp große T i- Plasmid. (T i= Tumor induzierend) Dieses trägt neben dem Replikationsursprung die Virulenzgene, die T-DNA und Gene für den Opinkatabolismus. Die gesamte T-DNA liegt zwischen zwei sie rechts und links begrenzende, 25bp großen Sequenzwiederholungen (left bzw. right border). Die T-DNA trägt Gene für die Synthese der Pflanzenhormone Auxin und Cytokin sowie Gene für Opine und wird als einzelsträngige DNA in das Pflanzenzellgenom integriert. Opine sind seltene Aminosäurederivate des Arginins zu denen z.B Octopin und Nopalin gehören und dienen A.tumefaciens als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und können nicht von der Wirtszelle weiterverarbeitet werden. Die Virulenzgene sind für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle essentiell.
Wie verläuft die Infektion?

Eine Infektion der Pflanze erfolgt durch Verletzung , z. B. mit einem Ackergerät, im Bereich des Wurzel-Spross-Übergangs.

  • verwundete Pflanzenzellen geben phenolische Verbindungen ab. A. tumefaciens wird chemotaktisch angelockt. Konzentrationen von 10 -7 mol reichen aus.
  • diese Signalmoleküle werden von transmembranen Rezeptorkomplexen (die von virA kodiert werden) auf der Oberfläche der Bakterienzelle detekiert
  • virA kann seinerseits virG durch Phosphorylierung aktivieren, welches daraufhin an regulatorische Regionen der anderen Vir-Gene auf dem T i-Plasmid bindet und die Expression weiterer Vir- Gene steuert.
  • virD2 schneidet als Endonuklease an der left und right border die T-DNA aus (Einzelstrang)
  • virE2 bindet sich an den gebildeten Einzelstrang und schützt ihn so vor dem Abbau durch Nucleasen und geleitet die T-DNA zur bakteriellen Membran.
  • über einen wahrscheinlich von virB –Proteinen gebildeten Porenkomplex gelangt die T-DNA in die Pflanzenzelle
  • bei virE2 wurden Nucleuslokalisationssignale gefunden, die für den Transport der T-DNA durch die Kernporen wichtig scheinen
  • die Integration erfolgt unspezifisch ins Pflanzenzellgenom
Infektionsprozess (2)

A. tumefaciens in der Gentechnik

 
Agrobacterium tumefaciens wird in der Gentechnik zum vektorvermittelten Gentransfer eingesetzt. Dazu werden die Tumorgene der T-DNA entfernt und durch ein „gene of intest“ ersetzt. Dies können z.B Resistenzgene gegen Bakterien-, Viren- oder Insektenbefall sowie Gene zur Qualitätsverbesserung sein. Prominentestes Beispiel ist der B.t Mais. Hier wurde ein Toxin -Gen aus Bacillus thuringiensis übertragen. Zwei Typen von Plasmiden werden eingesetzt:
 
1. Binäre Vektoren
 
Hier befindet sich zwischen left&right border das „gene of Interest“ vor einer Promotorsequenz sowie ein pflanzlicher Selektionsmarker, ebenfalls unter der Kontrolle eines Promotors. Außerhalb der T- DNA trägt der Vektor einen origin of Replikation (Replikationsursprung) für Agrobakterium und E.coli, sowie einen bakteriellen Selektionsmarker. Zuerst wird der Vektor in E.coli vermehrt und dann in A. tumefacines transformiert. Hier ist ein sogenanntes Helferplasmid vorhanden, dass die für die Übertragung der T-DNA essentiellen vir- Gene enthält. Die Integration des T-DNA erfolgt dann nach dem oben erläuterten Schema.
2. Co- integrierte Vektoren
 
Rechts: Bei diesem Vektortyp wird kein Helferplasmid benötig, da die vir- Gene auf dem gleichen Pasmid vorhanden sind.

Zur Seletion der Pflanzenzellen, die die T-DNA in ihr Genom integriert haben, kommt der pflanzliche Selektionsmarker (Antibiotikaresitenz oder Herbizidresistenz) zum Einsatz. Ausgehend von dieser Pflanzenzelle wird eine neue Pflanze regeneriert, z.B mittels somatischer Embryogenese.


Quellen

http://arabidopsis.info/students/
http://www.bio.davidson.edu/Biology/kabernd/seminar/2002/method/dsmeth/ds.htm
Quellen - Bilder
1) http://www.nsf.gov/od/lpa/news/press/images/derek2_big.jpg
2) http://www.chemistry.emory.edu/faculty/lynn/research/agro/viravirg.jpg

 

Henrike Peuschel , Februar 2005


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