Southern/Northern Blot und RT-PCR

Southern/Northern Blot und RT-PCR

Danach muss die Membran getrocknet werden und das so genannte Crosslinking kann stattfinden. Dabei wird die DNA dauerhaft auf der Membran fixiert, indem sie mit UV-Licht bestrahlt wird. Durch das UV-Licht werden bestehende chemische Bindungen gebrochen, die sich anschließend durch die Maschen der Membran neu ausbilden. Es folgt eine Hybridisierung mit den markierten DNA-Sonden mit komplementärer Sequenz. Häufig sind die Sonden α-³²P-dATP oder DIG markiert.
Die Sonde muss zunächst erhitzt werden um die Doppelstränge zu trennen und wird mit einer Hybridisierungslösung auf die Membran gegeben. In einer Glasröhre wird alles unter mehrerem Wenden mehrere Stunden in einen Ofen bei 40 bis 60 C° erhitzt. So wird gewährleistet, dass die Sonde spezifisch an die gesuchte Zielsequenz binden kann. Um ungebundende Sondenteile zu entfernen, wird mit einer Salzlösung niedriger Konzentration gewaschen.
Nun kann die Detektion je nach gewählter Sondenmarkierung stattfinden. Bei der α-³²P-dATP-Markierung befindet sich das Radioaktive Phosphorisotop 32P auf dATP und sendet deshalb ständig Betastrahlen. Bei Auflegen auf einen Röntgenfilm, wird diese Stelle geschwärzt. Eine moderne Alternative ist das Auflegen auf einen Phospho-Imager-Screen. Das ist eine spezielle Platte, deren Beschichtung durch Strahlung nachhaltig chemisch verändert wird. Diese Veränderung kann mit einem Lesegerät in den Computer eingelesen und dort weiter bearbeitet werden. Die Platte kann anschließend regeneriert und erneut verwendet werden.
Bei der DIG-Markierung wird ausgenutzt, dass in die DNA während des Kopierens an manchen Stellen dUTP statt dTTP eingebaut wird. An dieses dUTP wird Digoxigenin angehängt. Das wird mit anti-DIG-Antikörper gebunden, woran ein Enzym gekoppelt ist, welches eine Reaktion katalysiert wobei Licht entsteht. Beim Auflegen auf Fotopapier kann diese Markierung sichtbar gemacht werden. Der Vorteil dabei ist, dass diese Markierung nicht radioaktiv ist.
Daraufhin kann das Stripping folgen. Durch Eintauchen in eine Strippinglösung und erhitzen wird die Sonde entfernt. Anschließend ist die Behandlung bis zu 20 mal mit anderen Sonden möglich.

Die RT-PCR versteckt hinter ihrem Namen die Reverse Transkriptase polymerase chain reaction. Ihr Ziel ist der Nachweis von Genexpression von spezifischen Genen in Zelle, Blutserum, Gewebe etc. Da aber RNA nicht amplifiziert werden kann, muss sie zunächst mit einer viralen reversern Transkriptase in cDNA translatiert werden.Eingesetzte Reverse Transkriptasen können zum Beispiel veränderte Enzymvarianten aus Retrovieren (wie der "Moloney Murine Leukemia Virus" (M-MLV RT) oder "Avian Myeloblastosis Virus" (AMV RT)) sein. Sie alle benötigen, wie andere Polymerasen auch, Primer (oft Oligo-d(T)) um am poly-A-Schwanz am 3'-Ende der mRNA zu binden. Wird ein Oligo-d(T) verwendet, ist ein zweiter Schritt der PCR nötig, in dem der Gen-spezifische Primer eingesetzt wird, um sicher zu stellen, dass nur die gewünschte DNA-Sequenz amplifiziert wird. Eine modernere Variante ist die One-Step-RT-PCR, bei der gleich ein Gen-spezifischer Primer verwendet wird. So können beide Reaktionen hintereinander im selben Gefäß ausgeführt und Kontaminationen verhindert werden. Die Amplifikation der DNA erfolgt während jeder PCR durch mehrere Zyklen, bestehend aus Denaturation der DNA, Annealing (spezifisches Binden der Primer) und Extension (Elongation des komplementären Doppelstranges durch die Polymerase).

Da die cDNA komplementär zur ursprünglichen mRNA ist, kann dadurch die Aminosäuresequenz eines Proteins abgeleitet werden. Die mRNA in Eukaryoten ist bereits gespleißt, also Intron frei. Dadurch ermöglicht die cDNA Informationen ob ein Gen in verschieden Isoformen exprimiert wird, d.h. ob die mRNA alternativ gespleißt wird.
Anschließend müssen die PCR-Produkte in einer Gelelektrophorese auf Agarosegel aufgetrennt werden, meist mit dem Floureszensfarbstoff Ethidiumbromid, der in die Doppelhelix eingebaut wird. So können die DNA-Fragmente unter UV-Licht sichtbar gemacht werden.

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Southern Blot Mit dem Ziel eine Gensequenz in einem komplexen DNA-Gemisch nachzuweisen, wurde der Southern Blot 1975 von Edwin Southern entwickelt. Der Vorteil dieser Methode gegenüber älteren Verfahren liegt darin, dass nicht sämtliche Gen-Sequenzen eines DNA-Gemisches entschlüsselt sein müssen. Zunächst muss die genomische DNA aus den zu untersuchenden Zellen isoliert werden. Das kann beispielsweise durch Alkalische Lyse geschehen. Anschließend muss die DNA isoliert und aufgereinigt werden. Um kurze DNA-Fragmente für die Auftrennung durch eine Gelelektrophose zu erhalten, muss die DNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen behandelt werden. Dann werden DNA -Gemisch und Molekulargewichtsmarker auf das Gel für die Elektrophorese aufgetragen. Durch Anlegen einer elektrischen Spannung erfolgt eine Auftrennung der DNA ausschließlich nach Größe. Nach der Auftrennung muss das Gel mit einer Denaturierungslösung behandelt werden, damit die DNA einzelsträngig vorliegt um eine spezifische Bindung der markierten DNA-Sonden nach dem Blotting zu ermöglichen.
Für den Transfer vom Gel auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose), das Blotting, stehen mehrere Verfahren zur Verfügung: · Kapillar-Blot: Eine Flüssigkeit zieht die DNA mit, meist eine Salzlösung. Diese läuft von unten über das Gel auf die Membran, da sich darüber saugfähiges Material befindet. Die DNA bleibt dabei in den Maschen der Membran hängen. Wie der Name schon sagt, funktioniert der Kapillar-Blot durch die Kapillarkräfte. Es darf allerdings keine Luft eindringen, da an diesen Stellen kein Transfer der DNA stattfinden kann. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Flüssigkeit 10 bis 12 Stunden laufen muss und ein hoher Verbrauch der Salzlösung einhergeht. · Vakuum-Blot: Die Flüssigkeit wird, ähnlich dem Kapillar-Blot durch die Membran gezogen, nur dass die Flüssigkeit von einem Vakuum durch Gel und Membran gezogen wird. Der Vorteil hier gegenüber dem Kapillar-Blot besteht darin, dass er sparsamer und schneller ist. · Elektro-Blot: Hierbei wird die negative Ladung der DNA ausgenutzt. Das Gel liegt nahe der negativ geladenen Kathodenplatte, über der Membran befindet sich die positiv geladene Anodenplatte. Am besten man verwendet eine Salzlösung, denn durch sie kann der Strom fließen. Wird nun eine Sannung angelegt, bewegt sich die DNA Richtung Anode und bleibt in der Membran hängen.
	Agarosegel unter UV-Licht
Danach muss die Membran getrocknet werden und das so genannte Crosslinking kann stattfinden. Dabei wird die DNA dauerhaft auf der Membran fixiert, indem sie mit UV-Licht bestrahlt wird. Durch das UV-Licht werden bestehende chemische Bindungen gebrochen, die sich anschließend durch die Maschen der Membran neu ausbilden. Es folgt eine Hybridisierung mit den markierten DNA-Sonden mit komplementärer Sequenz. Häufig sind die Sonden α-³²P-dATP oder DIG markiert. Die Sonde muss zunächst erhitzt werden um die Doppelstränge zu trennen und wird mit einer Hybridisierungslösung auf die Membran gegeben. In einer Glasröhre wird alles unter mehrerem Wenden mehrere Stunden in einen Ofen bei 40 bis 60 C° erhitzt. So wird gewährleistet, dass die Sonde spezifisch an die gesuchte Zielsequenz binden kann. Um ungebundende Sondenteile zu entfernen, wird mit einer Salzlösung niedriger Konzentration gewaschen. Nun kann die Detektion je nach gewählter Sondenmarkierung stattfinden. Bei der α-³²P-dATP-Markierung befindet sich das Radioaktive Phosphorisotop 32P auf dATP und sendet deshalb ständig Betastrahlen. Bei Auflegen auf einen Röntgenfilm, wird diese Stelle geschwärzt. Eine moderne Alternative ist das Auflegen auf einen Phospho-Imager-Screen. Das ist eine spezielle Platte, deren Beschichtung durch Strahlung nachhaltig chemisch verändert wird. Diese Veränderung kann mit einem Lesegerät in den Computer eingelesen und dort weiter bearbeitet werden. Die Platte kann anschließend regeneriert und erneut verwendet werden. Bei der DIG-Markierung wird ausgenutzt, dass in die DNA während des Kopierens an manchen Stellen dUTP statt dTTP eingebaut wird. An dieses dUTP wird Digoxigenin angehängt. Das wird mit anti-DIG-Antikörper gebunden, woran ein Enzym gekoppelt ist, welches eine Reaktion katalysiert wobei Licht entsteht. Beim Auflegen auf Fotopapier kann diese Markierung sichtbar gemacht werden. Der Vorteil dabei ist, dass diese Markierung nicht radioaktiv ist. Daraufhin kann das Stripping folgen. Durch Eintauchen in eine Strippinglösung und erhitzen wird die Sonde entfernt. Anschließend ist die Behandlung bis zu 20 mal mit anderen Sonden möglich.

RT-PCR
Die RT-PCR versteckt hinter ihrem Namen die Reverse Transkriptase polymerase chain reaction. Ihr Ziel ist der Nachweis von Genexpression von spezifischen Genen in Zelle, Blutserum, Gewebe etc. Da aber RNA nicht amplifiziert werden kann, muss sie zunächst mit einer viralen reversern Transkriptase in cDNA translatiert werden.Eingesetzte Reverse Transkriptasen können zum Beispiel veränderte Enzymvarianten aus Retrovieren (wie der "Moloney Murine Leukemia Virus" (M-MLV RT) oder "Avian Myeloblastosis Virus" (AMV RT)) sein. Sie alle benötigen, wie andere Polymerasen auch, Primer (oft Oligo-d(T)) um am poly-A-Schwanz am 3'-Ende der mRNA zu binden. Wird ein Oligo-d(T) verwendet, ist ein zweiter Schritt der PCR nötig, in dem der Gen-spezifische Primer eingesetzt wird, um sicher zu stellen, dass nur die gewünschte DNA-Sequenz amplifiziert wird. Eine modernere Variante ist die One-Step-RT-PCR, bei der gleich ein Gen-spezifischer Primer verwendet wird. So können beide Reaktionen hintereinander im selben Gefäß ausgeführt und Kontaminationen verhindert werden. Die Amplifikation der DNA erfolgt während jeder PCR durch mehrere Zyklen, bestehend aus Denaturation der DNA, Annealing (spezifisches Binden der Primer) und Extension (Elongation des komplementären Doppelstranges durch die Polymerase).	PCR (Schema)
Da die cDNA komplementär zur ursprünglichen mRNA ist, kann dadurch die Aminosäuresequenz eines Proteins abgeleitet werden. Die mRNA in Eukaryoten ist bereits gespleißt, also Intron frei. Dadurch ermöglicht die cDNA Informationen ob ein Gen in verschieden Isoformen exprimiert wird, d.h. ob die mRNA alternativ gespleißt wird. Anschließend müssen die PCR-Produkte in einer Gelelektrophorese auf Agarosegel aufgetrennt werden, meist mit dem Floureszensfarbstoff Ethidiumbromid, der in die Doppelhelix eingebaut wird. So können die DNA-Fragmente unter UV-Licht sichtbar gemacht werden.