FSBio-Hannover

[TobiWan]

Naja, ich darf mich an "Der Wurzel" erfreuen und z.B. mit der Frage "Sinn der Endodermis - Funktion bei Beschädigung" weiß ich auch noch nichts so richtig anzufangen. Bei Beschädigung der Endodermis oder des Cortex oder was?
Is ja noch ne Woche hin.

Es macht doch auch viel mehr Spass, dass Genetikbegriffe wie 5'RAPD in keinem Genetikbuch im Stichwortverzeichnus auftauchen. Hab via google rausgefunden, dass das "random amplified polymorphic dna" heißt und wie's funktioniert, aber was das "5'" soll, keine Ahnung.

Have a nice day,
Tobi

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"Instant human! Just add coffee."

[Minc]

https://fsbio-hannover.de/phpBB2/viewtopic.php?t=45

take a look tobi(wan)... vielleicht hilft's...

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- ownage - Angaben wie immer ohne Gewähr.

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[Jo]

Gibt da so einige Stichpunkte, die man nicht zuordnen kann bzw. versteht. Da ist es üblich Mut zu Lücke zu lassen oder andere zu nerven

ps: Bin keine MiBi-Genetik-Leuchte, aber hatte Verlandung und See bei Küster

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“Allein sein müssen ist das Schwerste, allein sein können das Schönste.”
Hans Krailsheimer

Keep on cruising...
Jo

[Tobi]

... wo wir gerade beim Thema sind: Kann mir jemand 5'RACE bzw. 3'RACE erklären? Finde ich auch in keinem Buch und selbst im Internet ist nur " Und dann verwendeten wir 5'RACE gemäß den Angaben des Kit - Herstellers" oder Ähnliches zu finden...´

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Gruß,

Tobi

Wer sich die Welt immer nur von hinten ansieht, was erwartet der denn zu sehen ausser lauter Arschloechern?

[Minc]

https://fsbio-hannover.de/phpBB2/viewtopic.php?p=96#96

.. scheinbar waren meine stolpersteine von früher auch die der heutigen jugend.. *G*..

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- ownage - Angaben wie immer ohne Gewähr.

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[TobiWan]

@ Minc: Das sagt mir immer noch nicht, warum da ein "5'" davorsteht.
Prinzipiell steht der Sinn der Sache ja mit "genomic fingerprinting" und RFLPs in einer Reihe, nur dass man diesmal sich nicht die VNTRs und/oder Restriktionsschnittstellen rausgreift, sondern einfach irgendwelche 'random' Sequenzen.

@ Tobi: Bis jetzt habe ich auch nur rausgefunden, dass das rapid amplification of cDNA ends heisst. 5' bzw. 3' bezeichnet, welches Ende du amplifizierst. In das Ganze ist auch wieder eine PCR involviert. Wie und warum das findet man nirgends - einfach toll.

Vielleicht kann ja mal einer der Hauptstudiums-Genetiker da was zu sagen!?!?!

Danke Minc, ich seh's mir mal an!

Have a nice day,
Tobi

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[TobiWan]

5'RACE mal in anderen Worten:
Ich habe eine mRNA, auf der eine mir bekannte Gensequenz liegt, die sich aber nicht am 5'-Anfang, sondern irgendwo mittendrin befindet. Ich will jetzt aber wissen, was sich in 5'-Richtung von meiner bekannten Sequenz befindet (5' und 3' beziehen sich auf die Lage der unbekannten Sequenz auf der mRNA!). Um überhaupt irgendetwas nachweisen zu können brauche ich aber mehr genetisches Material, d.h. ich führe eine PCR durch.
Da eine PCR aber nur mit DNA funktioniert und RNA sowieso viel zu instabil ist, muss ich meine mRNA erstmal mit reverser Transkriptase behandeln. Dafür brauche ich aber erstmal einen Primer.
Da die einzige bekannte Sequenz auf der mRNA die am vorderen 5'-Ende meines bekannten Gens ist, verwende ich einen antisense-Primer für selbige, der mir somit einen (antisense)-cDNA-Strang zu dem Teil der mRNA liefert, der in 5'-Richtung meines bekannten mRNA-Gens liegt (uff, langer Satz).
Um eine PCR von meinem cDNA-Strang anstellen zu können, brauche ich leider 2 Primer, die diese Sequenz flankieren. Einen kenne ich schon, nämlich den für die reverse Transkription verwendeten. Den anderen kann ich nicht kennen, da er zum unbekannten Bereich komplementär sein muss. Ich könnte natürlich sequenzieren, aber das würde Zeit verschwenden (edit - Nein, könnte ich nicht so einfach, da ich nicht genug DNA habe, oder ich müsste ewig ss-cDNA-Kopien von der ollen mRNA-Template ziehen).
Also schaffe ich mir meine bekannte Sequenz selber, indem ich durch eine Terminale Desoxynukleotidyl Transferase (TdT) einen poly(A)- oder poly(C)-"Schwanz" an das 3'-Ende der cDNA synthetisieren lasse ( "TdT-Tailing"). Somit kann ich einen poly(T)- oder poly(G)-Primer für die PCR verwenden. Da dieser Primer im Gegensatz zum bekannten nicht-selbstgeschaffenen anderen Primer aber relativ unspezifisch ist, verwende ich ihn nur im ersten Durchgang, der Vorverstärkung. Bei der weiteren 1. und 2. Nachverstärkung, verwende ich hingegen spezifischere Primer, die ineinander verschachtelt (= "nested") sind somit zunehmend spezifischere Amplifikate erzeugen.
Woher man die Sequenz für diese Primer hat? Keine Ahnung - Vielleicht verwendet man auch nur längere poly-Primer, aber die könnte man ja auch gleich am Anfang einsetzen???

3'RACE steht nicht auf der Stichwortliste und ist auch wahrscheinlich komplizierter. Der Primer bekannter Sequenz zeigt zum Beispiel in die falsche Richtung. Der erste Schritt müsste also sein, einen künstlichen zu schaffen. 5'RACE ist einfacher.

Insgesamt also eine RT-PCR (reverse transcriptase) mit einer Primer-komplementären Sequenz, die man sich selbst schafft.

Also mir selber hat's im Verständnis geholfen.

Ich hoffe, euch auch,
Tobi

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[TobiWan]

Ausschauen müsste das so - hab das mal in 10 mins skizziert.


Die spezifischeren Primer (türkis) verkürzen im Laufe der PCR wohl die tail-Region, vg.l AFLPs (wenn das tatsächlich Amplifikat-Fragment-Längen-Polymorphismus heisst, wie ich mal vermute).

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[Tobi]

Okay, erstmal respect @Tobi!
Das sollte doch in einer Prüfungssituation reichen, um mit 5' RACE klarzukommen.
Also vielen Dank!

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Gruß,

Tobi

Wer sich die Welt immer nur von hinten ansieht, was erwartet der denn zu sehen ausser lauter Arschloechern?

[Spaky]

Hi, kann noch was zum thema 3´pcr loswerden...
zum einen: komplizierter ist sie nicht! (leichter auch nicht, leider...
)

sie wird aus denselben gründen eingesetzt wie die 5´pcr!- das heisst das 5´ende meiner cdna ist unbekannt

sie funktioniert zuerst wie eine normale rt- pcr, das heisst ich verwende zur translation einen poly-t primer,an dessen 5´ende ich einen beliebigen, aber mir bekannten schwanz aus nucleotiden gehängt habe- den nutze ich nach der reversen transkription dazu, eine sogenannte nested pcr zu machen: da der schwanz lang genug ist kann ich an ihm 2 primer ansetzten.- das heißt, ich führe 2 aufeinander aufbauende pcrs durch (was dann nested=verschachtelt) genannt wird).Schematisch dargestellt:

1.) pcr mit erstem primer- liefert produkt 1
2.) pcr vom produkt mit 2. primer- liefert produkt 2

jetzt steht noch die grosse frage aus, warum die nested pcr überhaupt genutzt wird...also:es ist damit möglich, sehr geringe mengen an template nachzuweisen, ausserdem ist sie spezifischer, da 2 pcrs mit spezifischen primern durchgeführt werden...was fehler, die im ersten amplifikationsschritt auftreten können, wieder eliminiert!

wen es interessiert: so was findet man im "der experimentator, molekularbiologie" von cornel mülhardt...

wünsch euch allen viel glück für alle prüfungen!

[CTD - Agrani]

Hm, ne, 3'RACE dient zur Amplifikation der 3' Enden, sagt der Name ja schon fast. Einfacher isses auch. Wegen der 3' polyadenylierten mRNA.

Und die Adaptersequenz am Poly T Primer verwendet man auch bei 5'RACE. Wüsste nicht, was da verkürzt werden sollte ...

MfG, und selbst viel Glück.

[TobiWan]

[Gast]

An dem zur Vorverstärkung verwendeten Poly-T Primer hängt eine Sequenz dran, an die bei der nächsten PCR ein anderer binden kann. Die anderen nested Primer sind genspezifisch und liegen "innen" vom ersten.

Bei 3' RACE ist die cDNA 5' schon getailt.

Das war jetzt sehr ordentlich... in Euren Quellen dürfte es auch ordentlich stehen ....

[CTD - Agrani]

Nein, bei 3' RACE nimmt wegen am Anfang gleich zwei Primer.

MfG

[Minc]